Иммунофлуоресцентный анализ

Сущность иммунофлуоресцентного метода состоит в визуализации антигенов специфичными антителами (связка «антиген-антитело») при помощи флуоресцентных маркеров. Образцами для проведения иммунофлуоресцентного анализа являются клеточные суспензии (культуры бактерий, вирусов, клеток, микоплазм, риккетсий), образцы костного мозга, крови, тонких срезов ткани и альвеолярных смывов. Оценка и исследование могут осуществляться вручную с помощью флуоресцентного микроскопа или в автоматическом режиме с применением проточного цитометра, а также микрочипового цитометра. Кроме этого, применяются конфокальный микроскоп и флуоресцентный роботизированный микроскоп (в т.ч. в соединении с проточным цитометром) одновременно с программным обеспечением для обработки изображений. С помощью существующих на данный момент автоматизированных технологий можно анализировать до пятидесяти разных антигенов в одном образце с применением разнообразных флуоресцентных маркеров в рамках цитометрии и высокоинформативной микроскопии. Примерно до двадцати пяти антигенов одновременно можно исследовать при помощи конфокальной микроскопии или же проточной цитометрии.

В базовой методике иммунофлуоресцентного анализа выделяют следующие методы:

• прямой МФА – в суспензию клеток или на исследуемый препарат наносится раствор антител, прямо помеченных флуоресцентным красителем. Связка «антиген-антитело» выявляется флуоресцентным сигналом в форме свечения различной четкости и интенсивности;
• непрямой МФА – на препарат помещаются антитела против нужных антигенов («первые» антитела), а потом - специфические «вторые» антитела к «первым» антителам, с целью избегания неспецифичных реакций. В данном случае лишь «вторые» антитела конъюгируются с флуоресцентным красителем.

Результаты микроскопической оценки в ручном режиме описываются в так именуемых «крестах» (начиная с одного «+» и заканчивая четырьмя «++++») – субъективное визуальное оценивание исследователем градации выраженности реакции. В автоматизированных методиках в качестве детекторов применяют фотоумножители, а также флуоресцентные фотокамеры с высокой чувствительностью, что позволяет совершать регистрацию сигнала с максимальной точностью и дает показатель относительного уровня флуоресценции в большом диапазоне шкалы измерений. Абсолютное значение определяется при помощи контролей или же антигенов с постоянным известным содержимым в образце. Обработка данных в автоматическом режиме совершается специально разработанными программами обработки изображений и анализа цитометрической информации.

Иммунофлуоресцентный анализ имеет ключевое значение для лечения и ранней диагностики онкозаболеваний (онкогематология, иммуногистохимия), диагностике инфекционных болезней (к примеру, выявление клеток CD4+ при ВИЧ-инфекции, вирусов простого герпеса, цитомегаловируса), а также наследственных синдромов и заболеваний, передающихся половым путем (хламидиоз, уреаплазмоз). Кроме этого, иммунофлуоресцентный анализ применяется с целью обнаружения бактерий, которые с трудом поддаются культивированию (напр., Legionella pneumophila, вызывающая пневмонию).